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25-羥基維生素D，簡稱25-OH VD，包括25-羥基維生素D2（25-OH VD2）和25-羥基維生素D3（25-OH VD3）作為維生素D在體內(nèi)的主要代謝形式之一，由于其半衰期長、存在形式穩(wěn)定而被認(rèn)為是維生素D營養(yǎng)水平的標(biāo)志物。如何快速準(zhǔn)確檢測人體內(nèi)維生素D的水平越來越受到廣大學(xué)者和醫(yī)患人員的重視。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高的特點(diǎn)，被認(rèn)為是評(píng)價(jià)維生素D營養(yǎng)狀況的"黃金標(biāo)準(zhǔn)"測定法。本應(yīng)用案例采用Cleanert SLE 96孔板進(jìn)行血清樣品前處理，并使用LC-MS/MS進(jìn)行樣品測試，結(jié)果表明該實(shí)驗(yàn)方法具有良好的穩(wěn)定性及可靠性，可為臨床研究提供一種解決方案。

目標(biāo)物信息

材料及儀器

Cleanert SLE 96孔板（300mg/well）、Cleanert M96 生物樣品前處理儀、Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀、96孔接收板及Durashell C18-L（3.0*50 mm, 5 μm, 150 ?）均來自天津博納艾杰爾科技有限公司；LC-MS/MS, QTRAP 5500（SCIEX）；25-OH VD2，25-OH VD3，d3-25-OH VD2以上三種標(biāo)準(zhǔn)品由合作單位提供贊助；d6-25-OH VD3（購自Altascientific）；甲醇；甲酸；水；氫氧化鈉；異辛烷。

樣品處理方法

樣品預(yù)處理

取100 μL血清至潔凈樣品瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液，再加入100 μL 50 mM氫氧化鈉水溶液混勻后待凈化。

SLE過程

上樣：把預(yù)處理的樣品全部上樣，待全部浸潤后靜置5 min。

洗脫：用2 mL的異辛烷進(jìn)行洗脫，每次洗脫加入500 μL，最后一步洗脫結(jié)束，將Cleanert SLE與收集板整體放到Cleanert M96 生物樣品前處理儀上，開啟壓力至0.02 MPa，約30 s，完全收集洗脫液。

將洗脫液室溫下用Cleanert V96 樣品氮吹濃縮儀進(jìn)行溫和氮吹干，使用200 μL 0.1% FA 甲醇/水（8/2）復(fù)溶，進(jìn)樣檢測。

儀器檢測條件

HPLC條件

色譜柱：Durashell C18-L（3.0*50 mm, 5 μm, 150 ?）

流速：500 μL/min

柱溫：30 ℃

進(jìn)樣量：5 μL

表1 液相條件

質(zhì)譜條件

掃描模式：電噴霧電離正模式

采集模式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）

表2 參數(shù)信息

結(jié)果

線性范圍與靈敏度

使用不含目標(biāo)物的血清樣品配制10個(gè)不同濃度的校準(zhǔn)曲線點(diǎn)，25-OH VD2的濃度分別為：2、4、10、30、60、120、200、400、800、1000 ng/mL；25-OH VD3的濃度分別為：1、2、5、15、30、60、100、200、400、500 ng/mL；所得樣品采用上述樣品前處理方法凈化樣品并進(jìn)行檢測，獲得結(jié)果見表3。

表3 線性范圍及靈敏度

方法精密度與準(zhǔn)確度

為考察方法精密度與準(zhǔn)確度，取低、中、高三個(gè)濃度的樣本，每個(gè)濃度平行處理5個(gè)樣，獲得數(shù)據(jù)見表4.

表4 精密度與準(zhǔn)確度

色譜圖

將經(jīng)Cleanert SLE凈化的樣品按上述LC-MS/MS測試條件進(jìn)行測試，獲得譜圖見圖3-4.

血樣中大量存在的磷脂是造成液質(zhì)聯(lián)用基質(zhì)效應(yīng)的主要原因，為考察PPT、LLE與Cleanert SLE技術(shù)去除磷脂的能力，特取磷脂兩對(duì)特征離子對(duì)進(jìn)行考察：496/184, 524/184，獲得對(duì)比圖見圖5-6.

圖3 25-OH VD3血清加標(biāo)色譜圖（濃度為15 ng/mL）

圖4 25-OH VD2血清加標(biāo)色譜圖（濃度為30 ng/mL）

圖5 PPT-LLE-SLE樣品磷脂對(duì)比譜圖（離子對(duì)496/184）

圖6 PPT-LLE-SLE樣品磷脂對(duì)比譜圖（離子對(duì)524/184）

結(jié)論

本應(yīng)用呈現(xiàn)了一種簡單、高效的樣品前處理方法，通過Cleanert SLE 96孔板可高通量凈化血樣并萃取富集脂溶性維生素D代謝物25-OH VD2與25-OH VD3，本實(shí)驗(yàn)方法易操作且穩(wěn)定，可在臨床研究及藥物代謝領(lǐng)域替代耗時(shí)、低效的液液萃取技術(shù)。

訂貨信息表

應(yīng)用編號(hào)：YB10011